乌司他丁对内毒素血症心肌损伤大鼠线粒体通路介导细胞凋亡的影响

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-6880.2017.04.005

中华危重症医学杂志(电子版) ›› 2017, Vol. 10 ›› Issue (04) : 235 -241. doi: 10.3877/cma.j.issn.1674-6880.2017.04.005

所属专题：文献；

论著

乌司他丁对内毒素血症心肌损伤大鼠线粒体通路介导细胞凋亡的影响

刘国娟¹, 周丽华²^,^†(

), 张利鹏², 杨大刚³

^1. 010059　内蒙古自治区呼和浩特，内蒙古自治区人民医院重症医学科
^2. 010050　内蒙古自治区呼和浩特，内蒙古医科大学第一附属医院重症医学科
^3. 314000　浙江嘉兴，嘉兴市第二附属医院重症医学科

收稿日期:2016-12-26 出版日期:2017-08-01
通信作者: 周丽华
基金资助:
内蒙古自然科学博士基金项目(2010BS1108)

Effect of ulinastatin on cell apoptosis mediated by mitochondrial pathways in endotoxic myocardial injury rats

Guojuan Liu¹, Lihua Zhou²^,^†(), Lipeng Zhang², Dagang Yang³

^1. Department of Intensive Care Medicine, Inner Mongolia People's Hospital, Hohhot 010059, China
^2. Department of Intensive Care Medicine, the First Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010050, China
^3. Department of Intensive Care Medicine, the Second Affiliated Hospital of Jiaxing City, Jiaxing 314000, China

Received:2016-12-26 Published:2017-08-01
Corresponding author: Lihua Zhou
About author:
Corresponding author: Zhou Lihua, Email: xiulika@163.com

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引用本文：

刘国娟, 周丽华, 张利鹏, 杨大刚. 乌司他丁对内毒素血症心肌损伤大鼠线粒体通路介导细胞凋亡的影响[J]. 中华危重症医学杂志(电子版), 2017, 10(04): 235-241.

Guojuan Liu, Lihua Zhou, Lipeng Zhang, Dagang Yang. Effect of ulinastatin on cell apoptosis mediated by mitochondrial pathways in endotoxic myocardial injury rats[J]. Chinese Journal of Critical Care Medicine(Electronic Edition), 2017, 10(04): 235-241.

目的

探讨线粒体通路介导的细胞凋亡在内毒素血症大鼠心肌损伤中的机制及乌司他丁对该通路的影响。

方法

将24只雄性Wistar大鼠分为三组：对照组、内毒素组及乌司他丁组，每组各8只大鼠。内毒素组与乌司他丁组大鼠腹腔注射脂多糖10 mg/kg，乌司他丁组大鼠1 h后再次腹腔注射乌司他丁20 000 U/kg，对照组大鼠于同一时间点注射同等剂量的等渗NaCl溶液。观察各组大鼠心肌组织病理变化，采用酶联免疫吸附试验测定血清中心肌肌钙蛋白T（cTnT）、脑钠肽（BNP），并计算心肌细胞凋亡指数。同时，采用免疫组织化学法检测心肌细胞中Bcl-2、Bax、CytC、Caspases-3的表达。

结果

内毒素组大鼠心肌组织损伤严重，乌司他丁组大鼠心肌组织虽然有损伤，但病变较内毒素组轻。三组大鼠cTnT、BNP水平比较，差异均有统计学意义（F = 69.217、18.250，P均< 0.05），内毒素组与乌司他丁组大鼠cTnT[（20.3 ± 1.0）、（18.7 ± 1.3）、（12.2 ± 1.0）μg/L]、BNP[（26.6 ± 1.4）、（23.0 ± 2.4）、（17.0 ± 1.6）μg/L]水平显著高于对照组，且内毒素组更高（P均< 0.05）。乌司他丁组大鼠凋亡指数明显低于内毒素组[（19.8 ± 1.7）% vs.（22.6 ± 1.2）%，t = 3.675，P = 0.020]。同时，内毒素组及乌司他丁组大鼠Bcl-2的表达显著高于对照组[（80.3 ± 3.8）、（76.6 ± 2.90）、（49.6 ± 3.9）]，且内毒素组大鼠更高（P均< 0.05），而Bax[（70.8 ± 1.7）、（80.0 ± 4.8）、（99.7 ± 5.6）]、CytC[（120 ± 5）、（132 ± 3）、（151 ± 7）]、Caspases-3[（108.8 ± 4.0）、（113.9 ± 5.2）、（157.2 ± 2.5）]蛋白表达在内毒素组及乌司他丁组均显著低于对照组，且内毒素组更低（P均< 0.05）。

结论

乌司他丁可能通过抑制线粒体通路的激活，减少心肌细胞凋亡的发生，对内毒素血症心肌损伤起到了一定的保护作用。

关键词: 内毒素血症, 细胞凋亡, 心肌, 线粒体, 大鼠, 乌司他丁

Objective

To discuss the influence of ulinastatin on cell apoptosis mediated by mitochondrial pathways in endotoxic myocardial injury rats.

Methods

A total of 24 male Wistar rats were randomly divided into three groups: the control group, the endotoxin group and the ulinastatin group, 8 rats in each group. Rats in the endotoxin group and ulinastatin group both received 10 mg/kg lipopolysaccharide by intraperitoneal injection, and rats in the ulinastatin group were given 20 000 U/kg ulinastatin 1 h after injection. Rats in the control group only injected equal dose saline at the same time. The pathological changes of myocardial tissues were observed. The serum troponin T (cTnT), and brain natriuretic peptide (BNP) levels were detected by enzyme-linked immunosorbent assay, and the myocardial cell apoptosis index was calculated. The expressions of Bcl-2, Bax, CytC, Caspases-3 proteins in myocardial cell were also determined by immunohistochemistry.

Results

Rats in the endotoxin group had severe myocardial tissue damage, while rats in the ulinastatin group had a slightly myocardial tissue damage. The levels of cTnT, BNP all showed significantly differences among these three groups (F = 69.217, 18.250; all P < 0.05); the cTnT expressions [(20.3 ± 1.0), (18.7 ± 1.3), (12.2 ± 1.0) μg/L] and BNP expressions [(26.6 ± 1.4), (23.0 ± 2.4), (17.0 ± 1.6) μg/L] in the endotoxin and ulinastatin groups were much higher than those in the control group, and were highest in the endotoxin group (all P < 0.05). The myocardial cell apoptosis index in the ulinastatin group was much lower than that in the endotoxin group [(19.8 ± 1.7)% vs. (22.6 ± 1.2)%, t = 3.675, P = 0.020]. Meanwhile, the expression of Bcl-2 in the endotoxin and ulinastatin groups was much higher than that in the control group [(80.3 ± 3.8), (76.6 ± 2.90), (49.6 ± 3.9)], and was highest in the endotoxin group (all P < 0.05); the expressions of Bax [(70.8 ± 1.7), (80.0 ± 4.8), (99.7 ± 5.6)], CytC [(120 ± 5), (132 ± 3), (151 ± 7)] and Caspases-3 [(108.8 ± 4.0), (113.9 ± 5.2), (157.2 ± 2.5)] in the endotoxin and ulinastatin groups were lower than those in the control group, and were lowest in the endotoxin group (all P < 0.05).

Conclusion

Ulinastatin may reduce the occurrence of myocardial cell apoptosis by inhibiting the activation of mitochondrial pathways, and plays a certain protective role on endotoxic myocardial injury.

Key words: Endotoxemia, Apoptosis, Myocardium, Mitochondria, Rats, Ulinastatin

图1 各组大鼠心肌组织病理染色结果。注：a图为对照组大鼠显示心肌细胞、细胞间质、血管及组织建构完整；b图为内毒素组大鼠显示细胞核消失、变性坏死，局部可见炎症细胞浸润，间质血管扩张充血、渗出，心肌纤维断裂，组织结构严重紊乱；c图为乌司他丁组大鼠显示心肌细胞有变性、缺血、微小坏死灶，心内膜下充血（HE染色　× 400）

表1 各组大鼠血清cTnT浓度及BNP浓度的比较（μg/L， ± s）

组别	只数	cTnT	BNP
对照组	8	12.2 ± 1.0	17.0 ± 1.6
内毒素组	8	20.3 ± 1.0^a	26.6 ± 1.4^a
乌司他丁组	8	18.7 ± 1.3^ab	23.0 ± 2.4^ab
F值	?	69.217	18.250
P值	?	< 0.05	< 0.05

表1 各组大鼠血清cTnT浓度及BNP浓度的比较（μg/L， ± s）

组别	只数	cTnT	BNP
对照组	8	12.2 ± 1.0	17.0 ± 1.6
内毒素组	8	20.3 ± 1.0^a	26.6 ± 1.4^a
乌司他丁组	8	18.7 ± 1.3^ab	23.0 ± 2.4^ab
F值	?	69.217	18.250
P值	?	< 0.05	< 0.05

图2 各组大鼠心肌组织TUNEL法染色结果。注：TUNEL：末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法（terminal dexynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling）；a图为对照组大鼠显示心肌细胞核呈蓝色，未见棕色的阳性表达；b图为内毒素组大鼠显示心肌细胞核呈现棕黄色的阳性表达；c图为乌司他丁组大鼠显示心肌细胞核呈现出散在的阳性表达（TUNEL法　× 400）

表2 各组大鼠心肌组织Bcl-2、Bax、CytC、Caspases-3蛋白的表达（平均灰度值， ± s）

组别	只数	Bcl-2	Bax	CytC	Caspases-3
对照组	8	49.6 ± 3.9	99.7 ± 5.6	151 ± 7	157.2 ± 2.5
内毒素组	8	80.3 ± 3.8^a	70.8 ± 1.7^a	120 ± 5^a	108.8 ± 4.0^a
乌司他丁组	8	76.6 ± 2.9^ab	80.0 ± 4.8^ab	132 ± 3^ab	113.9 ± 5.2^ab
F值	?	129.792	102.139	93.488	174.314
P值	?	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05

表2 各组大鼠心肌组织Bcl-2、Bax、CytC、Caspases-3蛋白的表达（平均灰度值， ± s）

组别	只数	Bcl-2	Bax	CytC	Caspases-3
对照组	8	49.6 ± 3.9	99.7 ± 5.6	151 ± 7	157.2 ± 2.5
内毒素组	8	80.3 ± 3.8^a	70.8 ± 1.7^a	120 ± 5^a	108.8 ± 4.0^a
乌司他丁组	8	76.6 ± 2.9^ab	80.0 ± 4.8^ab	132 ± 3^ab	113.9 ± 5.2^ab
F值	?	129.792	102.139	93.488	174.314
P值	?	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05

图3 各组大鼠心肌组织Bcl-2、Bax、CytC、Caspases-3的表达结果。注：a~c图分别为对照组、内毒素组及乌司他丁组大鼠心肌组织Bcl-2表达情况，a图显示心肌细胞胞质呈现大量棕黄色的阳性表达，b图显示心肌细胞胞质呈现淡黄色的阳性表达，c图显示心肌细胞胞质呈现散在阳性表达；d~f图分别为对照组、内毒素组及乌司他丁组大鼠心肌组织Bax表达情况，d图显示心肌细胞胞质未见阳性表达，e图显示心肌细胞胞质呈现较深的棕黄色表达，f图显示心肌细胞胞质呈现散在的淡黄色表达；g~i图分别为对照组、内毒素组及乌司他丁组大鼠心肌组织CytC表达情况，g图显示心肌细胞未见阳性表达，h图显示心肌细胞胞质呈现大量棕黄色的阳性表达，i图显示心肌细胞胞质呈现少量淡黄色的阳性表达；j~l图分别为对照组、内毒素组及乌司他丁组大鼠心肌组织Caspases-3表达情况，j图显示心肌细胞胞浆中未见阳性表达，k图显示心肌细胞胞浆呈现大量棕黄色的阳性表达，l图显示心肌细胞胞浆呈现少量淡黄色的阳性表达（免疫组织化学染色　× 400）

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