短时间高氧对肺泡Ⅱ型上皮细胞线粒体活性氧产生及相关通路的影响

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-6880.2020.06.005

目的

探讨短时间高氧对肺泡Ⅱ型上皮细胞（AECⅡ）线粒体Ca²⁺ /烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）/沉默信息调节因子3（SIRT3）/超氧化物歧化酶2（SOD2）通路及活性氧的影响。

方法

将RLE-6TN细胞株细胞分为对照组、高氧组及线粒体钙通道拮抗剂组（拮抗剂组）。对照组细胞置于常规细胞培养箱中，高氧组细胞置于氧浓度为90%的培养箱中，拮抗剂组细胞加入钌红（2 μmol / L）后置于氧浓度为90%的培养箱中，各组均持续培养4 h。随后，对各组细胞线粒体内Ca²⁺、活性氧、NAD⁺、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）含量进行检测，并计算NAD⁺ / NADH比值；同时，采用实时荧光定量PCR检测SIRT3和SOD2信使RNA（mRNA）水平。

结果

各组间细胞线粒体内Ca²⁺、活性氧、NAD⁺、NADH、NAD⁺ / NADH比值及SIRT3 mRNA、SOD2 mRNA表达水平的比较，差异均有统计学意义（F = 183.500、135.900、32.140、51.520、128.300、59.970、45.020，P均< 0.001）。且与对照组及拮抗剂组比较，高氧组细胞线粒体内Ca²⁺[（19.5 ± 0.8）、（17.2 ± 0.7）、（24.3 ± 0.3）nmol / L]、活性氧[（491 ± 9）、（480 ± 5）、（530 ± 6）相对荧光单位]及NADH[（0.85 ± 0.03）、（0.87 ± 0.04）、（1.06 ± 0.06）nmol / 10⁴ cells]含量均明显升高，而NAD⁺含量[（3.30 ± 0.12）、（3.24 ± 0.14）、（2.58 ± 0.29）nmol / 10⁴ cells]、NAD⁺ / NADH比值[（3.89 ± 0.15）、（3.71 ± 0.15）、（2.44 ± 0.27）]、SIRT3 mRNA[（1.01 ± 0.11）、（0.96 ± 0.08）、（0.45 ± 0.09）]及SOD2 mRNA[（1.01 ± 0.14）、（1.05 ± 0.11）、（0.48 ± 0.10）]表达水平均显著降低（P均< 0.05）。

结论

短时间高氧可通过AECⅡ线粒体内Ca²⁺ / NAD⁺ / SIRT3 / SOD2通路导致活性氧蓄积。

关键词: 高氧, 线粒体, 肺泡Ⅱ型上皮细胞, 活性氧

Objective

To explore the effect of short-term hyperoxia on the mitochondrial Ca²⁺ / nicotinamide adenine dinucleotide (NAD⁺) / silence information regulator 3 (SIRT3) / superoxide dismutase 2 (SOD2) pathway and reactive oxygen species (ROS) in alveolar epithelial type Ⅱ cells (AECⅡ).

Methods

The RLE-6TN cells were randomly divided into a control group, a hyperoxia group and a mitochondrial calcium channel antagonist group (antagonist group). Cells in the control group were placed in a conventional cell culture box, cells in the hyperoxia group were placed in a box with an oxygen concentration of 90%, and cells in the antagonist group were given ruthenium red (2 μmol / L) and then placed in a box with an oxygen concentration of 90%. The cells in all groups were cultured continuously for 4 h. Subsequently, the mitochondrial Ca²⁺, ROS, NAD⁺ and reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) contents were measured, and the NAD⁺ / NADH level was calculated. The messenger RNA (mRNA) levels of SIRT3 and SOD2 were detected by real-time fluorescent quantitative PCR.

Results

The mitochondrial Ca²⁺, ROS, NAD⁺, NADH, NAD⁺ / NADH, SIRT3 mRNA and SOD2 mRNA all showed significant differences among the three groups (F = 183.500, 135.900, 32.140, 51.520, 128.300, 59.970, 45.020; all P < 0.001). Compared with the control group and antagonist group, the contents of mitochondrial Ca²⁺ [(19.5 ± 0.8), (17.2 ± 0.7), (24.3 ± 0.3) nmol / L], ROS [(491 ± 9), (480 ± 5), (530 ± 6) relative fluorescence units] and NADH [(0.85 ± 0.03), (0.87 ± 0.04), (1.06 ± 0.06) nmol / 10⁴ cells] increased obviously, and the NAD⁺ content [(3.30 ± 0.12), (3.24 ± 0.14), (2.58 ± 0.29) nmol / 10⁴ cells], NAD⁺ / NADH [(3.89 ± 0.15), (3.71 ± 0.15), (2.44 ± 0.27)], SIRT3 mRNA [(1.01 ± 0.11), (0.96 ± 0.08), (0.45 ± 0.09)] and SOD2 mRNA [(1.01 ± 0.14), (1.05 ± 0.11), (0.48 ± 0.10)] decreased markedly in the hyperoxia group (all P < 0.05).

Conclusion

Short-term hyperoxia can increase the production of ROS by the Ca²⁺ / NAD⁺ / SIRT3 / SOD2 pathway in AECⅡ.

Key words: Hyperoxia, Mitochondria, Alveolar epithelial type Ⅱ cells, Reactive oxygen species

表1 各组RLE-6TN细胞间线粒体内Ca²⁺和活性氧含量的比较（ ± s）

组别	细胞数（个/ mL）	Ca²⁺（nmol / L）	活性氧（RFU）
对照组	2 × 10⁶	19.5 ± 0.8	491 ± 9
高氧组	2 × 10⁶	24.3 ± 0.3^a	530 ± 6^a
拮抗剂组	2 × 10⁶	17.2 ± 0.7^ab	480 ± 5^ab
F值		183.500	135.900
P值		< 0.001	< 0.001

表1 各组RLE-6TN细胞间线粒体内Ca²⁺和活性氧含量的比较（ ± s）

组别	细胞数（个/ mL）	Ca²⁺（nmol / L）	活性氧（RFU）
对照组	2 × 10⁶	19.5 ± 0.8	491 ± 9
高氧组	2 × 10⁶	24.3 ± 0.3^a	530 ± 6^a
拮抗剂组	2 × 10⁶	17.2 ± 0.7^ab	480 ± 5^ab
F值		183.500	135.900
P值		< 0.001	< 0.001

表2 各组RLE-6TN细胞间NAD⁺、NADH含量及NAD⁺ / NADH比值的比较（ ± s）

组别	细胞数（个/ mL）	NAD⁺（nmol /10⁴cell）	NADH（nmol /10⁴cell）	NAD⁺ / NADH
对照组	2 × 10⁶	3.30 ± 0.12	0.85 ± 0.03	3.89 ± 0.15
高氧组	2 × 10⁶	2.58 ± 0.29^a	1.06 ± 0.06^a	2.44 ± 0.27^a
拮抗剂组	2 × 10⁶	3.24 ± 0.14^b	0.87 ± 0.04^b	3.71 ± 0.15^ab
F值		32.140	51.520	128.300
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001

表2 各组RLE-6TN细胞间NAD⁺、NADH含量及NAD⁺ / NADH比值的比较（ ± s）

组别	细胞数（个/ mL）	NAD⁺（nmol /10⁴cell）	NADH（nmol /10⁴cell）	NAD⁺ / NADH
对照组	2 × 10⁶	3.30 ± 0.12	0.85 ± 0.03	3.89 ± 0.15
高氧组	2 × 10⁶	2.58 ± 0.29^a	1.06 ± 0.06^a	2.44 ± 0.27^a
拮抗剂组	2 × 10⁶	3.24 ± 0.14^b	0.87 ± 0.04^b	3.71 ± 0.15^ab
F值		32.140	51.520	128.300
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001

表3 各组RLE-6TN细胞间SIRT3、SOD2 mRNA水平的比较（ ± s）

组别	细胞数（个/ mL）	SIRT3 mRNA	SOD2 mRNA
对照组	2 × 10⁶	1.01 ± 0.11	1.01 ± 0.14
高氧组	2 × 10⁶	0.45 ± 0.09^a	0.48 ± 0.10^a
拮抗剂组	2 × 10⁶	0.96 ± 0.08^b	1.05 ± 0.11^b
F值		59.970	45.020
P值		< 0.001	< 0.001

表3 各组RLE-6TN细胞间SIRT3、SOD2 mRNA水平的比较（ ± s）

组别	细胞数（个/ mL）	SIRT3 mRNA	SOD2 mRNA
对照组	2 × 10⁶	1.01 ± 0.11	1.01 ± 0.14
高氧组	2 × 10⁶	0.45 ± 0.09^a	0.48 ± 0.10^a
拮抗剂组	2 × 10⁶	0.96 ± 0.08^b	1.05 ± 0.11^b
F值		59.970	45.020
P值		< 0.001	< 0.001

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